Orvosnak vagy mérnöknek készült, de családja anyagi helyzete miatt a teológiai tanulmányokat választotta. Azt remélte, hogy misszionáriusként eljuthat a trópusokra. Ezért jelentkezett a debreceni református teológiára, ahol szintén fontos ismeretséget kötött, ami a későbbi, távoli népek iránti érdeklődésében meghatározó szerepet játszott. Török József, a kollégium orvosa, antropológiai előadásain gyakorta hivatkozott John Lubbock „Történelem előtti idők” című, akkoriban magyarul is megjelent kötetére. Ekkor merült fel Bíróban, hogy érdemes lenne valamilyen távoli tájon, szinte még kőkori körülmények között élő népek közt kutatni, és ezáltal megismerni az egykori európai életmódot is. Mint írja, ettől kezdve akart utazó természetvizsgáló lenni. Szintén Török József írt ki pályázatot Debrecen fedelesszárnyú rovarainak rendszerezésére, melynek megnyerése után Bíró az ő segítségével került a budapesti református teológiára (1878–1879), hogy tanulmányai mellett a Nemzeti Múzeum Állattárában gyarapíthassa ismereteit. A természettudományok iránti elkötelezettsége miatt, és mert látta, hogy egyetlen misszióstársaság sem fogja alkalmazni, Bíró nem fejezte be a teológiát. Szíve szerinti tanulmányok végzésére azonban – a szükséges anyagi feltételek hiányában – továbbra sem volt lehetősége, így tanítóként szeretett volna elhelyezkedni. Ezt azonban az egyházi vezetés nem engedélyezte, így nevelő lett Dunaőrsön, majd Sátoraljaújhelyen. Itt a zempléni tiszti főorvos és rovarkutatónál, Chyzer Kornélnál dolgozott, aki ebben az időben írta meg – Bíró segítségével – a megye zoológiai monográfiáját, és akihez ettől kezdve szoros és mély barátság fűzte. Ekkor írta meg első tudományos dolgozatát, Adatok Zemplén vármegye természetrajzi ismeretéhez címmel. Utóbb Chyzer segítségével a budapesti Országos Phyloxera Kísérleti Állomáson kapott filoxérabiztosi állást (1881–1886) , mellyel párhuzamosan a Rovartani Lapokat szerkesztette és publikált. Állásában azonban nem véglegesítették, így újra tanító lett Rákospalotán, (1886–1888), majd a kecskeméti református kollégiumban (1888–1892). Az itt töltött évek alatt megírta Kecskemét állattani monográfiáját és különböző rovartani kutatásokra indult a Tátrába és Erdélybe. Nem házasodott meg, mert ahogy írta, a messzi utazás terve miatt nem akarta lekötni magát. 1893-ban végül beiratkozott a ELTE Bölcsészettudományi Karára; laboránsi fizetéséből és publikációiból tartotta fenn magát. Közben szakirodalmat olvasott, tanulmányozta a preparálási módszereket, nyelveket tanult és gyűjtött. A Magyarország fennállásának 1000. évfordulójára szervezett millenniumi ünnepségsorozatra (1896) való készülődés lázában – amikor közreműködésével megszületett az ország faunáját bemutató kiadvány, a Magyar Birodalom Állatvilága címmel – arra készült, hogy ő kezdje meg „a magyar zoológiában az új évezredet… távoli egzotikus tájak természeti újdonságainak megismertetésével”.

A terv pontos körvonalazódása egybeesett a Természettudományi Társulat 1895-ös ülésével, melyet az 1893-ban, Új-Guineában elhunyt természetrajzi és néprajzi gyűjtő, Fenichel Sámuel emlékére rendeztek. Bíró utazási elképzelése tehát találkozott a neves tudósok céljával, akik a gyűjtés folytatását sürgették. Ettől kezdve Herman Ottó, a neves néprajztudós támogatására is számíthatott, ami a múzeum vezetőségével szemben is hasznosnak bizonyult. Mivel – státusz hiányában – a múzeum nem küldhette ki saját kutatójaként, az induláshoz szükséges összeget Bíró csak úgy tudta előteremteni, hogy a Nemzeti Múzeumnak eladta 60 000 darabos rovargyűjteményét. A későbbiekre nézve pedig szerződést kötöttek, hogy a múzeum átveszi az általa gyűjtött rovarokat és tárgyakat, azok ellenértékét pedig elküldik Új-Guineába, hogy Bíró fenntarthassa magát. A múzeum számára szükségtelen küldeményeket Rosonowszky Frigyes preparátor vette át, és értékesítette Bíró megbízásából.

Bírót indulása előtt a Néprajzi Osztály dolgozói a lehetőségekhez mérten az etnográfiai gyűjtésre is felkészítették. Betekintést nyert Fenichel gyűjteményébe, megtanult fotózni és egy jó minőségű, a trópusi klímát is elviselő, Watson & Sons gyártmányú fényképezőgépet, vásároltak számára. Ezen kívül a múzeum egy évre való nyersanyaggal és könyvekkel is ellátta.

Bíró 1895. november 7-én hagyta el Budapestet. Genovai átszállással érkezett Szingapúrba, majd 1896. január 1-én szállt partra Német-Új-Guinea kormányzati székhelyén, az Astrolabe-öbölbeli Friedrich-Wilhelmshafenben.

Megérkezését követően Bíró a telep orvosánál, Ottó Dempwolffnál lakott. Az első hónapokban a környéken tett kisebb kirándulásokat, melyek alatt főleg természetrajzi gyűjtéseket végzett. Járt Stephansortban, a Siar-, Bilibili-, és a Graget-szigeten; Gorima Erima és Beliáu településeken a Gauta-folyó (Gogol) partján, illetve a Hansemann-hegységben. 1896. április végén Kärnbach német kereskedővel a Huon-öbölbe utazott, ahol június végéig maradtak, majd szintén együtt mentek Berlinhafenbe (Aitape). Bíró innen bejárta a Hansemann-partot, így Angiel-, Tamara-, Mabol-, Ali-, és Seleo-szigetét, ahol Kärnbach telepe volt (Lemien falu), és gyűjtött. A fehérek által alig lakott területen természetrajzi és etnográfiai szempontból is érintetlen területre lelt, részletesen lejegyezte a tárgyi kultúrára vonatkozó adatokat és unikális faragványokat szerzett a seleoi szellemházból. Az általa gyűjtött 747 néprajzi tárgyat és 42 fotót, jegyzeteivel együtt küldte haza, a Néprajzi Tár tisztviselői ezek alapján dolgozták fel és publikálták első gyűjteményét 1899-ben A Magyar Nemzeti Múzeum Néprajzi Gyűjteményei sorozat első, kétnyelvű köteteként, Bíró Lajos Német-Új-Guineai (Berlinhafeni) Néprajzi Gyűjtéseinek Leíró Jegyzéke (Beschreibender Catalog Der Ethnographischen Sammlung Ludwig Bíró-s Aus Deutsch-Neu-Guinea (Berlinhafen) címen.

Bíró október 9-én tért vissza az Astrolabe-öbölbe, és 1897 januárjában az addigra áttelepített kormányzati székhely, Stephansort mellett, Erimában telepedett le, ahol június elejéig tartózkodott. Ez idő alatt a környéken tett kirándulásokat Gorima, Erima, Bongu, Bogadjim, Uom, Wale és Cinyági falvakban, valamint a Hansemann-, Oertzten-, és a Konstantin-hegység településein, továbbá Bilibili-, Siar-, és Graget-szigeteken.

Az előző ott tartózkodásakor és az ekkor gyűjtött 859 tárgyat publikálta a múzeum katalógussorozatának harmadik köteteként, Bíró Lajos Német-Új-Guineai (Astrolabe-öböl) Néprajzi Gyűjtéseinek Leíró Jegyzéke. Beschreibender Catalog der ethnographischen Sammlung Ludwig Bíró’s aus Deutsch-Neu-Guinea (Astrolabe-bai) címen 1901-ben.

Bíró ezt követően hosszabb ideig, 1897 júniusa és 1898. július vége között nem adott életjelt magáról. Ez idő alatt Szingapúrban, illetve Jáván járt, hogy gyógyíttassa magát, Szingapúrban felkereste Buitenzorg botanikus kertjét, a helyi múzeumot és annak könyvtárát is, de erről az időszakról később sem számolt be részletesen.

Visszatérése után, 1899. szeptember közepéig a Huon-öbölben gyűjtött. Simbangból indulva – ahol a neuendettelsaui evangélikus misszió állomásán lakott – tett kisebb utakat Sattelberg környékére a kaikhoz, a bukauákhoz, a Gingala vidékre, a tengerparti jabimokhoz, a Tami-szigetre, Bubui és Kwálászán falvakba. A térség remek gyűjtési helyül szolgált. Az őslakók ekkor még alig érintkeztek az itt élő néhány telepessel, így Bíró egy érintetlen kultúra anyagát szerezhette meg.  Az onnan szűrmazó 1500 darabos néprajzi gyűjtemény 1900 februárjában érkezett Magyarországra.

A Huon-öbölbeli gyűjtés után, nem tudni pontosan mikor, Bíró Új-Britannia érintésével ismét az Astrolabe-öbölbe utazott, ahol Erimában, Stephansortban, és a Graget-szigeten végzett kiegészítő gyűjtést. Itt találkozott Robert Koch, későbbi Nobel-díjas német orvossal, aki 1900. január 4-én érkezett Stephansortba, hogy a malária elleni gyógymódot keresse. Bíró – aki ekkoriban betegsége miatt éppen Új-Zélandra készült – összebarátkozott vele, és miután Koch meggyógyította állandó maláriájából és az ahhoz kapcsolódó seblázból, vele tartott új-írországi körútjára, május 13–28. között. A kirándulás során érintették Gerrit-Denys szigetét, Új-Hannovert és a Sandwich-szigeteket. Május 30-án érkeztek Herbertshöhébe, ahonnan Bíró a French-szigetekre ment, Peter Hansen dán koprakereskedő telepére. Onnan október elején orvosi tanácsra Ausztráliába utazott, ahova Hansen is elkísérte. Itt felkereste a Blue Mountains akkor még feltáratlan vidékét, és egy november eleji gyűjtőnapló tanúsága szerint Springwoodban Victoriában, és Sydneyben is járt. Valószínűleg egy hónapot töltöttek ott, mielőtt visszaindultak a French-szigetekre. Hazafelé azonban Hansen összeveszett a hajó kapitányával, aki ezért megváltoztatta úti célját, és nem vitte el őket. Bírót Stephansortban tette partra, ahonnan 1901. január 8-án a Graget-szigetre utazott. Április elején visszatért az Astrolabe-öbölbe, Friedrich-Wilhelmhafenbe, majd az augusztust újra a Graget-szigeten töltötte. Májusban bejárta a Sepik és a Ramu-folyó torkolatvidékeit, Potsdamhafent és Bogia vidékét.

Hat év után, 1901. december 27-én indult haza. Útja során érintette Ceylont, Indiát, Ománt és Egyiptomot, végül 1902. január 27-én érkezett meg Budapestre. A Magyar Néprajzi Társaság, „páratlan néprajzi gyűjtéseit méltányolandó”, tiszteletbeli tagjává választotta. 1902-ben a Magyar Nemzeti Múzeum Állattárának tiszteletbeli őrévé nevezték ki. Mindent egybevetve a Néprajzi Múzeum több mint 5500 tárgyhoz és 342 fényképhez jutott Bíró jóvoltából, míg a Természettudományi Múzeum gyűjteményeiben több mint 200 000 természetrajzi tétel fűződik a nevéhez.

Az általa Melanéziában töltött idő hosszúsága és abból adódóan anyagismeretének mélysége, illetve néprajzi jegyzeteinek mennyisége (mintegy 2500 oldal) és részletessége tekintetében Bíró jóval megelőzte korát, nem túlzás őt a csak később normává váló állomásozó terepmunka egyik előfutárának tekinteni. Bíró munkásságának és gyűjteményének kivételes voltát, a feldolgozásában rejlő lehetőségeket ismerte fel a múzeum, amikor elérte, hogy a miniszter évi 4600 korona tiszteletdíjat ítéljen meg számára mindaddig, amíg gyűjteményét feldolgozza és Huon-öböli monográfiáját megírja. Mindebből azonban semmi nem valósult meg, egyedül az Új-Guineából haza írott leveleit adta ki.

Ugyanakkor hazatérését követő években tett még természetrajzi gyűjtőutakat, például 1903-ban Máltán és Tuniszban, melyekre egészségügyi okokból is szüksége volt. 1906-ban Krétára utazott, majd 1907-ben Nyugat-Európa, Bécs, Lausanne, Zürich, Párizs, Hága és London természettudományi múzeumait látogatta meg. Többször gyűjtött Erdélyben. 1905-ben a debreceni protestáns kollégium természetrajzi tanárnak hívta meg a tanszékre, amit azonban nem fogadott el, arra hivatkozva, hogy természetrajzi gyűjtései érdekében nem szeretné lekötni magát. 1918-ban a konstantinápolyi és ankarai múzeum természetrajzi anyagát határozta meg, 1928-ban pedig a Balkán-hegységben kutatott.

Az első világháború után szeretett volna újra eljutni a trópusokra. Elsősorban Új-Guineára gondolt. Az útja azonban az I. világháború miatt meghiúsult. 1922-ben, amint az ottani kormánynak írt levélfogalmazványából kiderül, Panamába, a Chiriqui-hegységbe akart utazni, felajánlva segítségét az ország természetrajzi feltérképezéséhez, azonban soha többé nem jutott el a trópusokra, és továbbra is csak kisebb utakra volt lehetősége. 1931. szeptember 2-án halt meg Budapesten. A Kerepesi úti temetőben helyezték örök nyugalomra, obeliszket állítva neki – ami azonban mára eltűnt.